Sequenziamento in un lampo

Il 6 febbraio 2007, i dirigenti di 454 Life Sciences hanno mostrato al 78enne James Watson una prima bozza del proprio genoma. C'era qualcosa di decisamente poetico in questo. Watson, naturalmente, aveva vinto un premio Nobel 45 anni prima per il suo ruolo nella scoperta della struttura a doppia elica del DNA; è stato anche uno dei primi promotori del Progetto Genoma Umano, che al suo completamento nel 2003 aveva speso quasi 3 miliardi di dollari in 13 anni per estrarre il progetto codificato da quelle eliche. Ora 454 si era spostato un passo oltre quel megaprogetto, che metteva in comune il DNA di molte persone per determinare la sequenza genetica di ciò che equivale a un modello umano. L'azienda e la sua cosiddetta macchina per il sequenziamento di nuova generazione avevano letto da soli il codice genetico di un individuo, uno il cui lavoro aveva fatto così tanto per rendere possibile il risultato.

Jonathan Rothberg di 454 crede che le sue macchine renderanno il sequenziamento così economico e veloce che diventerà pratico leggere i genomi degli individui.

Ma Jonathan Rothberg, che ha fondato 454 a Branford, CT, con il sogno di produrre una macchina di sequenziamento più efficiente di quelle disponibili per il Progetto Genoma Umano, non menziona la poesia quando racconta il suo incontro con Watson. Piuttosto, parla di denaro, velocità e un futuro in cui le persone comuni portano in giro i loro genomi personali su dischi, uno scenario sempre più plausibile. Ci è costato $ 200.000 per fare Jim Watson, sottolinea Rothberg. E lo abbiamo fatto principalmente a dicembre e gennaio.

Questa storia faceva parte del nostro numero di maggio 2007

• Vedi il resto del problema
• sottoscrivi

Rothberg, che ora presiede il consiglio di amministrazione di 454, sottolinea che Project Jim rimane un work in progress e richiederà più tempo e denaro. A febbraio, la società aveva sequenziato il DNA di Watson solo tre volte (ogni esecuzione aumentava la precisione e riempiva le lacune); sono stati necessari nove passaggi per produrre la sequenza finale della bozza del Progetto Genoma Umano. Ma ancora.

L'azienda di Rothberg è solo una delle tante, tra cui Illumina di San Diego e Applied Biosystems di Foster City, in California, che sviluppano macchine in grado di decodificare il DNA più velocemente che mai. E proprio come il costo della potenza del computer è crollato con la densità in costante aumento dei transistor sui chip, il prezzo del sequenziamento del DNA è diminuito rapidamente con l'avvento di queste macchine. Oggi, il prezzo di un genoma umano decodificato con sequenziatori del tipo utilizzato nel Progetto Genoma Umano sarebbe tra i 25 ei 50 milioni di dollari. Scende a circa $ 1 milione con le macchine di nuova generazione disponibili oggi e potrebbe arrivare a $ 100.000 entro il 2008.

Multimedia

• Visualizza un grafico dei segreti del sequenziamento.

Come ha dimostrato la storia dei computer, una maggiore potenza di elaborazione a un costo inferiore può portare ad applicazioni impreviste. Sulla scia del Progetto Genoma Umano, i ricercatori hanno dovuto affrontare difficili decisioni finanziarie su quali genomi sequenziare: scimpanzé o macaco, mucca o delfino, riso o manioca. Le nuove macchine consentono di sequenziare quasi tutto ciò che interessa. E poiché sempre più dati di sequenza fluiscono nei database, si stanno aprendo intere nuove aree di ricerca. Gli scienziati ora hanno una capacità senza precedenti di fare confronti tra le specie, facendo luce su tutto, dalle questioni evolutive alle ragioni genetiche delle differenze individuali nella resistenza e suscettibilità alle malattie. La ricerca condotta con le macchine di 454 e pubblicata nelle migliori riviste include il sequenziamento parziale di un genoma di Neanderthal e lo sviluppo di nuovi test per le mutazioni genetiche che causano il cancro, una tecnologia che può aiutare i medici a personalizzare i trattamenti per i loro pazienti.

L'ultimo anno è stato il periodo più entusiasmante per la genomica dai tempi dello Human Genome Project, afferma Eric Lander, primo autore della prima bozza pubblicata del progetto sul genoma umano e ora capo del Broad Institute for genomic medicine a Cambridge, MA . Il sequenziamento sta diventando abbastanza economico e abbastanza potente da poter essere applicato a qualsiasi problema. Sta in piedi il campo sulla sua testa. Francis Collins, che ha guidato il Progetto Genoma Umano per il National Institutes of Health, prevede che le nuove tecnologie di sequenziamento avranno profonde conseguenze per il futuro della ricerca biomedica e, in definitiva, per la pratica della medicina.

Una soluzione unica
L'ufficio di Jonathan Rothberg ha un tema da tavola calda, con un pavimento a scacchiera rossa e nera, sedie cromate ricoperte di Naugahyde rossa e un divano con braccioli che imitano la parte posteriore di una Cadillac del 1959, completo di pinne caudali mostruose e luci posteriori a forma di proiettile . Invece di una scrivania, ha un bar con sgabelli da bar. Bottiglie di vino provenienti da un vigneto del Connecticut di sua proprietà allineano alcuni scaffali. Oltre le finestre si trova il Long Island Sound. Il posto urla sono Unico . E così è Rothberg. Nel 1991, mentre completava il suo dottorato di ricerca in biologia alla Yale University, ha avviato CuraGen, una delle prime aziende a sviluppare farmaci basati sulla genomica. Oltre a CuraGen e 454 Life Sciences, ha fondato un istituto per lo studio delle malattie infantili e un'altra azienda biotecnologica, RainDance Technologies, che ha sviluppato quelli che chiamano circuiti stampati liquidi progettati per rendere più efficienti gli esperimenti manipolando piccole quantità di fluido. E tutto questo all'età di 43 anni.

In effetti, è stato l'interesse per l'unicità di ogni persona che alla fine lo ha portato a provare a progettare un sequenziatore che spera un giorno renderà i controlli del genoma di routine come lo sono ora gli esami del sangue. Rothberg sostiene le viscere della macchina 454, un vetrino con 1,6 milioni di pozzetti in miniatura, ciascuno largo circa 50 micrometri (circa la metà della larghezza di un capello umano) e profondo 55 micrometri. È questo chip che consente alla macchina di sequenziare il DNA così rapidamente, perché in ciascun pozzetto può essere eseguita una reazione chimica separata.

Il sequenziamento genico sfrutta il fatto che i due filamenti di un'elica del DNA sono complementari: delle quattro basi chimiche adenina, guanina, timina e citosina, che sono legate insieme in vari ordini su ciascun filamento, l'adenina si accoppia solo con la timina e guanina solo con citosina. Nella tecnica di sequenziamento più comunemente usata, che si basa su uno schema sviluppato 30 anni fa da Frederick Sanger dell'Università di Cambridge, i frammenti di DNA vengono separati in singoli filamenti ed esposti a nucleotidi liberi, che si legano all'originale As, Cs, Ts, e Gs per generare nuovi filamenti complementari. Questi filamenti variano in lunghezza perché alcuni dei nucleotidi liberi sono stati modificati per impedire che la reazione continui; quando una di queste basi si lega al suo bersaglio, la catena smette di crescere. E ciascuno di questi quattro tipi di terminatori di catena ha un diverso fluoroforo attaccato che diventa fluorescente quando viene colpito da un raggio laser. Una corrente elettrica separa i fili per dimensione e il laser legge i colori per determinare quale sia stata l'ultima base aggiunta a ciascuna catena, spiegando la sequenza. La stragrande maggioranza dei laboratori che fanno il sequenziamento oggi utilizza una macchina prodotta da Applied Biosystems che sputa circa due milioni di basi al giorno.

L'ultimo sequencer del 454 può leggere 300 milioni al giorno.

Il metodo 454 evita molti dei passaggi che richiedono più tempo del sequenziamento convenzionale, come la separazione dei trefoli per dimensione. A differenza del sequenziamento di Sanger, non termina le catene: registra le basi man mano che vengono aggiunte a un filamento in crescita. Innanzitutto, una molecola di DNA viene tagliata casualmente in diverse lunghezze. Quindi ogni frammento viene strappato in singoli fili e ogni filo è attaccato a una minuscola perlina separata. Un processo biochimico copia i singoli filamenti, in modo che da ogni perla sporgano 10 milioni di cloni. Ogni tallone viene quindi confezionato in uno degli 1,6 milioni di pozzi. As, Cs, Ts e Gs lavano i pozzetti in sequenza per sintetizzare nuovi filamenti complementari.

Ecco la parte veramente intelligente: utilizzando un metodo descritto per la prima volta da Pål Nyrén e dai colleghi del Royal Institute of Technology svedese, il sequenziatore di 454 registra istantaneamente quando viene aggiunta una base a ciascun filamento sfruttando il fatto che la reazione di legame rilascia una sostanza chimica chiamata pirofosfato. Nei pozzetti della macchina 454, il pirofosfato viene catturato da una cascata chimica che finisce per colpire l'enzima luciferasi (che si trova naturalmente nelle lucciole) emettendo un'esplosione di luce. Un dispositivo ad accoppiamento di carica standard del tipo utilizzato nelle fotocamere digitali e nei telescopi rileva ogni lampo, leggendo la sequenza di As, Cs, Ts e Gs in ogni frammento. Il processo può leggere da 200 a 300 basi di fila. Come nella sequenza convenzionale, i computer cercano le sequenze corrispondenti alla fine di un frammento e all'inizio di un altro, ricomponendo i frammenti nell'ordine corretto.

Il sequencer che 454 ha introdotto sul mercato nell'ottobre 2005 aveva alcune serie limitazioni. Poteva leggere solo 100 basi di fila (più lungo era il tratto di basi in ogni frammento sequenziato, più facile era assemblare un genoma completo), e aveva anche problemi a mappare accuratamente i tratti ripetitivi, diciamo, sei A uno dietro l'altro. Ma Rothberg dice che la filosofia di 454 era Get it out presto; fallo accettare. La società ha preso di mira per primi i primi utenti come Broad's Lander, sperando che avrebbero presto pubblicato risultati che si basavano sul sequencer. Prima devi prendere i primi ragazzi, ma il resto dei ragazzi, i seguaci, sono dove si trova il mercato, dice Rothberg. E leggono documenti sottoposti a revisione paritaria.

uomini di Neanderthal
Un articolo di uno dei primi utilizzatori che ha ricevuto ampia attenzione da parte degli scienziati e del pubblico è stato uno studio sul DNA di Neanderthal condotto da Svante Pääbo dell'Istituto Max Planck di antropologia evolutiva a Lipsia, in Germania. I Neanderthal, la specie più vicina all'uomo moderno, sono scomparsi circa 30.000 anni fa e più speculazioni che fatti circondano la loro relazione genetica con noi. Sebbene Pääbo avesse fatto alcuni studi precedenti con il DNA di Neanderthal, qualsiasi cosa oltre l'analisi rudimentale si era rivelata troppo difficile e costosa. Il problema è che nel corso di migliaia di anni, i pochi campioni conosciuti di DNA di Neanderthal dai fossili sono stati degradati a brevi frammenti di circa 50-75 paia di basi. Inoltre, il DNA è spesso contaminato da materiale genetico proveniente dai microrganismi e dagli esseri umani moderni che hanno maneggiato i fossili. Ma Rothberg credeva che la macchina 454 potesse analizzare molte brevi sequenze a basso costo, generando informazioni sufficienti per consentire agli scienziati di setacciare antichi tesori dalla spazzatura. Rothberg chiamò a freddo Pääbo, che accettò di collaborare.

Dopo aver sequenziato i geni di 70 campioni di ossa e denti di Neanderthal, il team di Pääbo e i ricercatori di 454 hanno trovato un campione, stimato in 38.000 anni, che aveva per lo più DNA pulito. Come riportato in un articolo pubblicato lo scorso autunno nel Natura , hanno quindi sequenziato un milione di paia di basi da meno di 200 milligrammi di materiale, un risultato che ha fornito indizi sul fatto che gli umani moderni e i Neanderthal si siano incrociati e quando le due specie si siano separate l'una dall'altra. Ancora più importante, il documento mostra che il sequenziamento di tutti e tre i miliardi di basi nel genoma di Neanderthal è fattibile. Ciò potrebbe aiutare a risolvere misteri come se i Neanderthal avessero la capacità genetica di parlare.

Stabilire se gli esseri umani e i Neanderthal si sono incrociati o addirittura hanno avuto la capacità di parlare tra loro può ottenere molta attenzione da parte della stampa e del pubblico, ma altre applicazioni per il sequenziamento ultrarapido del DNA potrebbero avere un impatto molto maggiore sulla medicina e sulle nostre vite. Il metodo di sequenziamento tradizionale esamina il DNA di molte cellule diverse. Ma se una di queste cellule è, diciamo, una cellula tumorale, la sua sequenza può differire leggermente da quella delle cellule sane. In questi casi, i computer selezionano la sequenza più comune e scartano le altre. I sequenziatori di nuova generazione come quelli commercializzati da 454 invece clonano e sequenziano singole molecole di DNA, consentendo un sondaggio ultra profondo che può portare alla luce varianti rare. (I sequenziatori tradizionali possono anche analizzare singole molecole, ma è proibitivo.) Le implicazioni del sequenziamento di singole molecole sono enormi per la medicina. Sebbene non sia pratico utilizzare il sequenziamento convenzionale per annusare le differenze del DNA tra cellule sane e malate, le nuove macchine possono eseguire facilmente tali esperimenti.

Matthew Meyerson, patologo clinico presso il Dana-Farber Cancer Institute di Boston, ha pubblicato uno studio che mostra come la macchina 454 può aiutare a scoprire mutazioni legate al cancro ai polmoni. I farmaci per il cancro del polmone ora disponibili prendono di mira il gene che Meyerson sta sequenziando e spera che i medici alla fine ottengano una migliore conoscenza su chi risponderà a quali farmaci scoprendo se il paziente ha una particolare mutazione. Immagino che in pochi anni tutti i malati di cancro avranno i loro tumori caratterizzati dal sequenziamento di singole molecole se la tecnologia continua a diminuire di costo, dice.

In una variazione su questo tema, Michael Kozal, un medico dell'AIDS a Yale, si è unito a 454 per eseguire un sequenziamento ultra profondo dell'HIV per determinare la presenza di popolazioni minori di virus resistenti ai farmaci. I primi test della tecnica su pazienti hanno rilevato circa il doppio dell'HIV resistente rispetto al sequenziamento di Sanger. Anche queste informazioni potrebbero aiutare i medici a individuare i regimi di trattamento, il che aumenterebbe il rapporto costo-efficacia. È pratico da fare nel nostro sistema, afferma il capo scienziato 454 Michael Egholm, che sta collaborando con Kozal. Prima, semplicemente non era conveniente.

Il mio genoma
George Church, un pioniere del sequenziamento presso la Harvard Medical School, afferma che il costo è la chiave. Poiché i loro prezzi diminuiranno nei prossimi anni, dice, queste macchine diventeranno una forza di democratizzazione che renderà i tradizionali sequencer quasi obsoleti, proprio come i personal computer hanno sostituito i mainframe. E questo porterà ad applicazioni che nessuno può ancora sondare. Se stessimo ancora lavorando con i mainframe, non accadrebbero molte cose interessanti, dice.

Church, che era tra la dozzina di ricercatori a proporre il Progetto Genoma Umano a metà degli anni '80, è uno dei pochi biologi la cui attrezzatura di laboratorio include una morsa da tavolo e un trapano a colonna. Usa attrezzature come questa per costruire i suoi sequencer di nuova generazione, di cui il suo laboratorio ha attualmente otto (vedi TR35, settembre/ottobre 2006) . Convinto che le aziende stiano pagando troppo per le loro macchine, si impegna a condividere liberamente il suo know-how con tutti i colleghi interessati. Paragona la sua filosofia alla mentalità del wiki e di Linux, dicendo: Se un gruppo di formiche si riunisce, può spostare una pianta di gomma.

La grande visione di Church è quella di incanalare l'inondazione a buon mercato di A, C, T e G in quello che chiama il Progetto Genoma Personale. Nello Human Genome Project, i ricercatori hanno ottenuto il DNA di diverse persone, ognuna delle quali, per motivi di privacy, rimane anonima. Quindi la sequenza finale rappresenta una persona composita con un conglomerato di diversi background genetici e storie mediche. Church vuole che il suo Progetto Genoma Personale decodifichi il DNA degli individui, che offriranno anche volontariamente le loro cartelle cliniche. Pubblicherà tutti i dati risultanti su Internet. Alla fine, immagina, milioni di persone si uniranno al progetto, pubblicando le loro sequenze, cartelle cliniche e, se lo desiderano, anche fotografie facciali online. Il mondo intero avrà quindi accesso a tutti i dati di cui ha bisogno per testare liberamente le ipotesi.

Sebbene Church abbia ricevuto sostanziali finanziamenti dal National Institutes of Health per sviluppare la tecnologia di sequenziamento, le questioni etiche, legali e sociali sollevate dal progetto Genome personale hanno impedito al NIH di sostenerlo, nonostante una revisione positiva di una domanda di sovvenzione nell'agosto 2005. Non appena ho ottenuto l'approvazione, l'NIH si è entusiasmato, e non necessariamente in senso positivo, dice. Ha tentato di affrontare i problemi di privacy e riservatezza, osservando che l'identità di nessuno deve essere resa pubblica e che NIH già finanzia progetti di genetica umana che hanno meno garanzie in atto.

La Chiesa riconosce che la conoscenza intima del proprio DNA potrebbe essere troppo per molte persone. Non permetti ai tuoi figli di navigare su siti di pornografia su Internet, dice, e in una certa misura non ti permetti di sfogliare i siti più spaventosi e disgustosi. Si aspetta che invece di accedere ai loro genomi grezzi, le persone avranno professionisti che li aiutino a interpretare le informazioni.

Nonostante la mancanza di fondi federali e le obiezioni etiche, Church sta procedendo, fiduciosa che i progressi nella tecnologia di sequenziamento porteranno avanti l'idea di un Progetto Genoma Personale, proprio come i progressi nella tecnologia dell'informazione hanno portato gli estranei a condividere i dati in modi che nessuno immaginava di quando l'Apple II a doppia unità floppy ha debuttato 30 anni fa. Crede che man mano che i sequenziatori diventeranno più efficienti e i costi continueranno a diminuire, la genomica personale decollerà su una scala che poche persone hanno ancora immaginato.

Vincere alla lotteria
Lo scorso ottobre, la X Prize Foundation ha annunciato un premio di 10 milioni di dollari per la produzione di sequenze altamente accurate di 100 genomi umani in 10 giorni o meno senza spendere più di 10.000 dollari per genoma. Uno dei primi partecipanti è stato il 454, che prevede di sviluppare perline ancora più piccole che spera consentiranno alle sue macchine di leggere ancora più DNA per corsa all'incirca allo stesso costo. Non abbiamo bisogno di nuova fisica o matematica per arrivare al genoma da $ 1.000, afferma Rothberg.

Tralasciando la questione di quando, o se, qualcuno rivendicherà l'X Prize, il sequenziamento del DNA continuerà sicuramente a scendere di prezzo e ad aumentare in accuratezza. Fino all'anno scorso, il sequenziamento stava davvero lottando per avere l'impatto sulla prossima era della genomica di cui aveva bisogno, afferma David Bentley, capo scienziato di Illumina. Fondamentalmente, il prezzo del sequenziamento tradizionale non stava calando abbastanza rapidamente. Ora il campo è molto più ottimista di prima, dice. Il sequenziamento di nuova generazione ha un ruolo enorme da svolgere.

Ascoltare gli scienziati spuntare le possibilità è come ascoltare i vincitori della lotteria. E la medicina personalizzata come il tipo di test e trattamento del cancro che Meyerson di Dana-Farber spera di aiutare a inaugurare è solo un punto di partenza. Bentley afferma che i nuovi sequenziatori apriranno finestre sulle vaste regioni non codificanti del genoma che attivano e disattivano i geni. Egholm di 454 nota che il Progetto Genoma Umano non ha effettivamente sequenziato fino all'ultimo frammento di DNA umano; potrebbero esserci ancora geni sconosciuti che un ulteriore sequenziamento può trovare. Broad's Lander immagina un torrente di nuove informazioni su cosa porta una cellula a differenziarsi in un tipo o nell'altro (un mistero centrale nella biologia dello sviluppo) e cosa controlla i diversi stati cellulari. Mi rendo conto che è più difficile da spiegare che curare il cancro, dice, ma alla fine è più importante, perché interesserà tutte le malattie.

Entro il prossimo anno, prevede Lander, gli scienziati saranno in grado di iniziare studi che generano terabase di informazioni: un trilione di A, C, T e G. Non ho mai nemmeno pronunciato la parola terabase prima dell'anno scorso, dice. E se tutti quei dati sono sul Web e sono disponibili gratuitamente, si svilupperà un tipo di biologia completamente diverso.

Jon Cohen, scrittore freelance con sede a San Diego e corrispondente per Scienza , sta lavorando a un libro che esamina le differenze genetiche che separano gli scimpanzé dagli umani.

nascondere