Sequenziamento di una singola molecola di DNA

In un angolo degli uffici di Helicos BioSciences a Cambridge, MA, uno schermo sulla faccia di quello che sembra un frigorifero gigante lampeggia un conto alla rovescia: 10 giorni, cinque ore e 51 minuti fino a quando non finisce di leggere la sequenza di tutto il DNA che ha stato alimentato in esso. La macchina ad alta produttività, una configurazione complessa di tubi, laser e prodotti chimici, contiene due piastre, ciascuna con 25 canali microfluidici incisi al suo interno. Ciascun canale è in grado di trattenere e sequenziare un campione di DNA separato. Sequenziando i campioni in parallelo, la macchina impiega solo un'ora per leggere 1,3 miliardi di basi chimiche, note come A, C, T e G, che costituiscono un filamento di DNA.

L'HeliScope è la prima macchina commerciale a sequenziare un singolo pezzo di DNA invece di uno copiato più volte. Ogni cella di flusso (sopra) ha 25 canali, ciascuno in grado di contenere 16 milioni di filamenti di DNA per il sequenziamento. Un rivestimento sulla superficie della cella ne consente il lavaggio pulito tra una reazione e l'altra.

Chiamato HeliScope, è il primo strumento commerciale in grado di leggere direttamente la sequenza di un singolo filamento di questo tipo, una capacità che gli conferisce il potenziale per una velocità senza precedenti. Infatti, afferma Stephen Quake, un bioingegnere della Stanford University che ha co-fondato l'azienda nel 2003, Helicos ha sostanzialmente costruito il sequenziatore di DNA più veloce del mondo. Sebbene non sia chiaro se la macchina produrrà una sequenza completa più rapidamente di quanto non facciano i sistemi concorrenti (i dati generati da una macchina per il sequenziamento devono ancora essere analizzati e uniti, un compito computazionalmente intensivo), Quake afferma che sta aprendo intere nuove aree di ricerca.

Questa storia faceva parte del nostro numero di luglio 2008

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L'HeliScope, introdotto all'inizio di quest'anno, si unisce a un'intensa corsa verso tecnologie di sequenziamento più veloci ed economiche. Il prezzo del sequenziamento di un genoma umano è sceso negli ultimi anni, dai 300 milioni di dollari spesi dal Progetto Genoma Umano per la sua prima bozza a meno di 100.000 dollari. Le applicazioni del sequenziamento a basso costo sono quasi illimitate, dalla diagnostica delle malattie alla ricerca che potrebbe produrre microbi progettati per produrre biocarburanti o medicinali.

In altre tecnologie di sequenziamento avanzate attualmente in uso, comprese quelle di Illumina, Applied Biosystems e 454 Life Sciences (acquisita da Roche lo scorso anno), il DNA da sequenziare deve essere amplificato o copiato molte volte; le copie vengono quindi lette simultaneamente per facilitare l'individuazione dei segnali fluorescenti che indicano la posizione di ciascuna lettera di DNA. Il sequenziamento di una singola molecola salta la fase di copiatura, il che significa che molti più campioni unici possono essere confezionati in un singolo esperimento di sequenziamento.

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• Guarda il processo di Helicos Biosciences per il sequenziamento di una singola molecola di DNA.

• Stephen Quake, cofondatore di Helicos Biosciences, parla di sequenziamento.

Inoltre, il sequenziamento di singole molecole può essere in grado di generare un quadro più completo del genoma. Questo perché quando il DNA viene amplificato, è più probabile che alcune stringhe vengano copiate con successo rispetto ad altre, quindi è più probabile che siano rappresentate nella sequenza finale. Allo stesso modo, le mutazioni genetiche rare possono non essere rappresentate perché non vengono copiate. Se alla fine della giornata puoi semplicemente mettere un singolo filamento di DNA su una piattaforma e sequenziarlo direttamente, è un enorme vantaggio, afferma Elaine R. Mardis, condirettore del Genome Center della Washington University di St. Louis.

Sveglio di notte
Con la tecnologia Helicos, il DNA da sequenziare viene prima tagliato in brevi pezzi lunghi circa 200 basi e iniettato in una cella a flusso, un vetrino specializzato. La cella a flusso è rivestita con minuscoli frammenti di DNA progettati per afferrare i frammenti mentre galleggiano, ancorandoli in posizione. I pezzi di DNA immobilizzati sono marcati con fluorescenza in modo che la loro posizione al microscopio a fluorescenza possa essere registrata da una telecamera. Quasi un miliardo di pezzi di DNA può essere analizzato in un singolo esperimento di sequenziamento, rispetto a circa 400.000-50 milioni per altre tecnologie.

La cella a flusso viene quindi annidata nell'HeliScope, dove il microscopio è sistemato in 400 libbre di granito del Vermont. Il peso aggiunto impedisce alle vibrazioni di interferire con i segnali che il dispositivo deve rilevare. Un complesso sistema ottico e un groviglio di tubi circondano il microscopio, collegandolo a quello che sembra un frigorifero in miniatura pieno di bottiglie di prodotti chimici appositamente realizzati.

Quando uno scienziato attiva la macchina, inizia una danza di fluidi precisamente coreografata. Un enzima chiamato DNA polimerasi e un singolo tipo di base marcata con fluorescenza, diciamo A, fluiscono nella cellula. L'enzima fa sì che gli A prendano il loro posto in filamenti di DNA in crescita che completano i filamenti nei campioni. (Ciascuna delle quattro basi può accoppiarsi solo con un'altra base, quindi una A aggiunta deve allinearsi di fronte a una T esistente e una C contro una G.) Una volta che la base contrassegnata in modo fluorescente è stata incorporata nel nuovo filo, la fotocamera dell'HeliScope può individuare la luce che emette. L'imager rileva un pennacchio, un cono di luce di 200 nanometri, dall'integrazione di una singola [base] su un singolo filamento di DNA, afferma Steve Lombardi, presidente di Helicos.

Altri metodi di sequenziamento avanzati utilizzano un approccio simile, noto come sequenziamento per sintesi. Ma a differenza di queste tecnologie, l'HeliScope è in grado di distinguere il segnale fluorescente non amplificato di una singola base che prende il suo posto su un filamento di DNA in crescita. Una chiave di questa capacità è un materiale antiaderente sviluppato dall'azienda, che riveste la superficie della cella a flusso e consente di lavarla accuratamente tra una reazione e l'altra: le basi fluorescenti residue renderebbero più difficile rilevare con precisione le singole reazioni di sequenziamento. È necessario assicurarsi che nessuna molecola di base in più si attacchi alla superficie, afferma Patrice Milos, direttore scientifico di Helicos. Questa è stata una delle più grandi sfide iniziali. Dopo ogni ciclo, i marcatori fluorescenti vengono ritagliati dalle basi appena incorporate e le sostanze chimiche rimanenti vengono lavate via. Il processo viene ripetuto in sequenza con ciascuna delle quattro basi.

L'HeliScope genera un'enorme quantità di dati grezzi ogni secondo. Ci vogliono dai cinque ai dieci giorni per leggere tutto il DNA che può essere caricato in due celle a flusso; per il sequenziamento, sono 400 milioni di filamenti di DNA per cellula, che possono generare 20 miliardi di basi di sequenza utilizzabile. Gli scienziati caricano la macchina, premono un pulsante sulla sua faccia e se ne vanno. Ma gli ossessionati dal sequenziamento possono utilizzare Internet per controllare i progressi della macchina nel cuore della notte, un evento comune a Helicos.

Una volta che l'HeliScope ha creato la sua serie di fotografie a fluorescenza, un centro di elaborazione dati integrato le converte in stringhe di lettere. Il software incolla questi pezzi insieme per formare una sequenza più lunga.

Mutazioni mancanti
In un articolo pubblicato su Scienza all'inizio di quest'anno, gli scienziati hanno riferito del loro uso dell'HeliScope per sequenziare il genoma del virus M13, una prova importante che il sequenziamento di singole molecole potrebbe essere utilizzato per leggere e assemblare la sequenza di un genoma completo. (Lungo circa 7.000 paia di basi, il genoma del virus M13 è minuscolo, circa un milionesimo delle dimensioni di un essere umano.) La tecnologia è così nuova che non è ancora chiaro a quali applicazioni sarà più adatta. Ma alcuni scienziati ritengono che il sequenziamento di singole molecole potrebbe essere particolarmente importante per comprendere come le variazioni genetiche contribuiscono alla malattia. Dopotutto, alcune rare mutazioni legate alla malattia potrebbero essere state perse in precedenti studi genomici perché non sono state copiate durante il processo di amplificazione.

Helicos sta ancora armeggiando con la tecnologia, sviluppando una chimica che potrebbe aumentare la velocità delle reazioni di sequenziamento e consentire l'ancoraggio di più pezzi di DNA a una cella di flusso. Insieme agli altri principali attori del settore, l'azienda spera di fornire una sequenza completa del genoma per $ 1.000, un risultato che segnerebbe l'inizio di qualcosa di totalmente nuovo in medicina: la capacità degli individui di accedere alle proprie informazioni genomiche.

Emily Singer è BAMBINI editore di biotecnologie e scienze della vita.

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