RNA da prescrizione

È champagne per tutti. Phil Zamore stappa il tappo da una bottiglia di Montaudon, inzuppando il tappeto nuovo di zecca. Tutti nel suo laboratorio riempiono un bicchiere per brindare al capo. Buone notizie inaspettate, spiega. Zamore, un biochimico della University of Massachusetts Medical School di Worcester, ha appena ricevuto un premio nazionale del valore di 1 milione di dollari in cinque anni. Il budget del laboratorio è appena triplicato.

Zamore è comprensibilmente stordito, e non si tratta solo di soldi. Il campo di Zamore, l'interferenza dell'RNA, o RNAi, ha solo pochi anni, ma ha preso d'assalto il mondo della biologia. L'RNAi è l'intuizione più entusiasmante della biologia negli ultimi dieci o due anni, afferma il premio Nobel Phillip Sharp, biologo del MIT. E il laboratorio di Zamore è uno dei pochi che fa avanzare il campo a un ritmo vertiginoso. Penso che tutti coloro che lavorano nel campo si sentano un po' senza fiato per i progressi, dice Zamore.

Questa storia faceva parte del nostro numero di dicembre 2002

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Il senso di eccitazione condiviso da Zamore, Sharp e altri ricercatori è fondato. Per decenni, i ricercatori hanno pensato che l'RNA fosse semplicemente il messaggero del DNA, che forniva servilmente i progetti proteici del DNA. Ma ora sembra che minuscoli doppi filamenti di RNA, introdotti in cellule o animali cresciuti in laboratorio, possano disattivare in modo rapido ed efficiente qualsiasi dato gene.

Le implicazioni sono mozzafiato, perché gli organismi viventi sono in gran parte definiti dall'attivazione e disattivazione dei geni squisitamente orchestrata. I biologi, fino ad ora, sono stati in grado di imitare questo processo di cambiamento solo in modo lento, ponderoso e indiretto. Ma la facilità con cui l'RNAi può disattivare i geni, dicono i ricercatori, sembra quasi mistica. Le tecniche di laboratorio che utilizzano l'RNAi sono già i metodi preferiti dai biologi per scoprire le funzioni di particolari geni. E promette un nuovo modo di curare direttamente le malattie, disattivando i geni chiave coinvolti in vari disturbi. Già, almeno otto aziende, inclusa una fondata da Zamore, Sharp e colleghi, stanno già lavorando a terapie RNAi per tutto, dalle malattie virali al cancro.

Il Santo Graal è trasformare tutto questo in droghe, dice Zamore. Essere in grado di darti un piccolo RNA interferente che interromperebbe l'espressione del tuo gene per il colesterolo alto. Ciò abbasserebbe il livello di epatite C che infetta il fegato. O forse, penso che forse nella più grande applicazione da torta nel cielo, che si concentrerebbe su un gene specifico per le cellule tumorali e ucciderebbe il tumore.

Non si sa quanto presto ciò potrebbe accadere. L'interferenza dell'RNA ha fatto irruzione nella coscienza del mondo scientifico durante l'incontro annuale della RNA Society a Banff, Alberta, nel maggio 2001. Lì, Sayda Elbashir, un postdoc nel laboratorio del biochimico Thomas Tuschl presso il Max Planck Institute for Biophysical Chemistry a Gttingen, in Germania, ha sbalordito i suoi ascoltatori con la notizia che minuscoli frammenti di RNA a doppio filamento disattivano rapidamente, facilmente e specificamente i geni nelle cellule umane, un ruolo mai visto prima dai ricercatori.

La maggior parte del pubblico era seduto lì dicendo a se stesso: La scienza è appena cambiata', ricorda il biochimico dell'Università del Michigan David Engelke. L'unica cosa che ha impedito il pandemonio era che ci era stato promesso questo genere di cose prima. Scettico, Engelke aspettò alcuni mesi. Poi questi rapporti hanno iniziato ad arrivare: cavolo, funziona davvero!'

La sorpresa dell'RNA

Fino a poco tempo fa, il ruolo piuttosto poco affascinante che i biologi avevano attribuito all'RNA era quello di un messaggero passivo, che trasmetteva informazioni genetiche dal DNA al meccanismo di produzione delle proteine ​​della cellula. In questo processo, il codice del DNA di un gene viene trascritto in una copia di RNA, che il macchinario cellulare traduce in una proteina. Nell'interferenza dell'RNA, brevi frammenti di RNA bloccano il processo distruggendo il messaggio lungo il percorso. I frammenti di RNA a doppio filamento conducono gli enzimi di taglio all'RNA che trasporta il messaggio genetico. L'RNA messaggero viene quindi sminuzzato e contrassegnato per la distruzione: il messaggio del gene viene effettivamente messo a tacere.

I biologi sanno da anni che le molecole di RNA a filamento singolo progettate per accoppiarsi con un RNA messaggero potrebbero interrompere la produzione di proteine, ma questo processo artificiale è inaffidabile anche in laboratorio. La natura, tuttavia, regola i geni usando l'RNA, in particolare le molecole a doppio filamento.

I primi accenni del fenomeno sono apparsi nel 1990, ma all'epoca i ricercatori non collegavano ciò che avevano osservato con l'RNA. Quell'anno, il biologo vegetale Rich Jorgensen, allora alla DNA Plant Technology di Oakland, in California, stava cercando di rendere le petunie viola una tonalità di viola più profonda. Ha inserito una nuova copia sovralimentata del gene che controlla la produzione di pigmento viola. Con sua grande sorpresa, ha ottenuto petunie bianche. Jorgensen riconobbe l'importanza di questo effetto paradossale, ma non riuscì a spiegare perché l'aggiunta di più di un gene avesse disattivato quel gene.

L'indizio successivo arrivò nel 1995, quando i genetisti della Cornell University clonarono un gene nel microscopico verme del suolo C. elegans . Per verificare la loro scoperta, hanno utilizzato un metodo di laboratorio standard per disattivare il gene: hanno aggiunto un singolo filamento di RNA che corrispondeva all'RNA messaggero. Questo filamento complementare si lega al messaggero, impedendogli di essere tradotto in una proteina. Inaspettatamente, un singolo filamento non complementare di RNA che stavano usando come controllo sperimentale e che non avrebbe dovuto fare nulla, ha anche spento il gene.

Nel 1998 il biochimico Andrew Fire, allora alla Carnegie Institution di Washington, e il genetista Craig Mello, alla University of Massachusetts Medical School, hanno risolto il mistero. Iniettando singoli filamenti complementari di RNA nei vermi, hanno ottenuto un effetto di silenziamento sorprendentemente potente quando i due filamenti si sono combinati. Dopo aver dimostrato che l'RNA a doppio filamento era il vero agente silenziatore, Fire e Mello coniarono il termine interferenza RNA e nacque un nuovo campo. In retrospettiva, i geni viola sovralimentati di Jorgensen hanno prodotto RNA a doppio filamento che hanno avuto lo stesso effetto sui geni viola nativi, essenzialmente spegnendoli.

L'RNA a doppio filamento sembrava fornire un mezzo più stabile e affidabile per spegnere geni specifici rispetto ai singoli filamenti, e i laboratori che stavano studiando organismi tra cui piante, vermi e mosche hanno adottato con entusiasmo il nuovo metodo. Tuttavia, l'interferenza dell'RNA non ha funzionato nei mammiferi: il sistema immunitario distrugge le cellule che contengono RNA a doppio filamento per difendersi da virus a RNA come quelli che causano l'epatite A e C. Poi è arrivata la rivelazione di Tuschl e Elbashir a Banff che segmenti di RNA molto corti, che hanno soprannominato piccolo RNA interferente, ha funzionato nelle cellule umane. A quel punto, racconta Sharp, l'intero campo è decollato.

Trattamento silenzioso

Ora gli investigatori stanno cercando modi per trasformare questo nuovo e potente ruolo dell'RNA in profitti aziendali. Praticamente tutte le aziende farmaceutiche utilizzano già l'interferenza dell'RNA come strumento per la scoperta di farmaci. Una delle strategie più popolari per trovare nuovi bersagli farmacologici consiste nell'eliminare o disabilitare i geni uno per uno per vedere cosa succede. Se, ad esempio, un animale malato può essere curato eliminando un particolare gene, la proteina di quel gene potrebbe costituire un buon bersaglio per i farmaci. L'utilizzo di piccoli RNA interferenti, si scopre, può accelerare radicalmente questo processo. Invece di spendere mesi o anni per progettare un knockout, i ricercatori usano gli RNA per spegnere in modo specifico e rapido un gene. Possono anche osservare se la disattivazione della proteina come farmaco provocherebbe effetti collaterali. Il processo si svolge in pochi giorni, anziché in un anno, afferma Christophe Echeverri, CEO di Cenix BioScience, un'azienda biotecnologica di Dresda, in Germania.

In ultima analisi, piccoli RNA interferenti potrebbero essere essi stessi farmaci: invece di bloccare una particolare proteina, come fanno i farmaci standard, l'RNAi impedirebbe la produzione della proteina. Lo scorso giugno, Sharp del MIT ha dimostrato che tali RNA, mirati a geni virali e umani chiave, potrebbero fermare l'infezione da HIV nelle cellule coltivate in laboratorio. In un esperimento, i ricercatori hanno mescolato cellule infette da HIV con piccoli RNA interferenti mirati ai geni virali. Gli RNA hanno fermato la riproduzione virale. Il gruppo di Sharp ha anche mescolato cellule non infette con piccoli RNA interferenti mirati al CD4, una proteina sulla superficie delle cellule attraverso la quale l'HIV ottiene l'ingresso. I ricercatori hanno dimostrato che gli RNA hanno ridotto la produzione di CD4. Due giorni e mezzo dopo, hanno esposto all'HIV le cellule trattate con RNA e le cellule non trattate. Il virus ha infettato il quadruplo delle cellule non trattate.

Nonostante i risultati incoraggianti, per il momento i farmaci RNAi sono ancora in fase di sogno, afferma Sharp. Ma Sharp ha considerato la prima promessa abbastanza allettante da fondare, con Zamore, Tuschl e altri due scienziati, la Alnylam Pharmaceuticals a Cambridge, MA, per sviluppare tali farmaci. La società era appena decollata quando ha ottenuto 17 milioni di dollari in finanziamenti di capitale di rischio lo scorso luglio.

Fare farmaci RNAi, però, non sarà facile. Per prima cosa, nessuno ha trovato metodi adatti per somministrare gli RNA all'uomo. C'è un problema di consegna. È così semplice, afferma il chimico dell'Università di Harvard Stuart Schreiber. Portare gli acidi nucleici ai loro tessuti bersaglio [è] un problema irrisolto in medicina. La terapia con RNAi è essenzialmente una terapia genica, afferma Schreiber, e dovrà affrontare gli stessi problemi - inefficienza, inefficacia ed effetti collaterali immunologici - che hanno bloccato quel campo dal 1999, quando Jesse Gelsinger morì durante una sperimentazione di terapia genica presso l'Università della Pennsylvania. I medici hanno usato virus modificati come veicoli di consegna, o vettori, per trasportare il DNA nelle cellule dell'adolescente. Il sistema immunitario di Gelsinger ha risposto in modo massiccio e fatale.

Sharp afferma che la speranza è che il piccolo RNA interferente potrebbe non aver bisogno di vettori per raggiungere il suo obiettivo, evitando così la maggior parte delle insidie ​​associate alla terapia genica basata sul DNA. Ma questo scenario è tutt'altro che certo. Puoi modificare gli RNA per renderli più stabili [e] per farli assorbire in modo più efficiente dalle cellule? chiede Sharp. Non lo sappiamo.

Avere un significato

La storia biomedica recente non aiuta a risolvere l'incertezza. In effetti, questa non è la prima volta che gli scienziati hanno provato a creare un farmaco basato sul silenziamento dell'RNA. Anche l'RNA o il DNA antisenso a filamento singolo può spegnere i geni e non ha bisogno di un vettore. All'interno della cellula, una molecola antisenso trova il suo RNA messaggero complementare e, come due lati di una cerniera, si legano strettamente, impedendo all'RNA messaggero di attraversare il meccanismo di produzione delle proteine ​​della cellula. Il risultato, almeno in teoria, è l'arresto genetico.

L'antisenso, tuttavia, è stato finora una delusione come base per nuovi farmaci. Dopo oltre un decennio di intenso lavoro di sviluppo, solo un farmaco antisenso - Vitravene di Isis Pharmaceuticals, per il trattamento di alcune rare infezioni oculari nei pazienti con AIDS - ha ottenuto l'approvazione della Food and Drug Administration. La prima generazione di farmaci antisenso, che sono stati testati nei primi anni '90, si degradavano rapidamente nel corpo, erano difficili da ottenere nelle cellule, spesso non riuscivano a trovare il loro obiettivo e causavano gravi effetti collaterali. Farmaci antisenso più stabili sono ora in fase di sperimentazione sugli esseri umani.

L'RNAi può fare meglio dell'antisenso? Non tanto presto, prevede Frank Bennett, vicepresidente per la ricerca antisenso all'Isis. Se si confronta l'RNAi con l'attuale versione dell'antisenso, non c'è davvero alcun vantaggio, dice. [Piccola interferenza] La tecnologia dell'RNA è davvero agli inizi. È in qualche modo equivalente a dove era l'antisenso 10 anni fa, quando stavamo appena iniziando a fare esperimenti sugli animali.

Ma le persone RNAi vedono la loro tecnologia come fondamentalmente diversa dall'antisenso. Il grande vantaggio qui di RNAi rispetto all'antisenso è che, ecco, questo funziona davvero, afferma il CEO di Cenix Echeverri. L'RNAi, dice, è molto più potente e affidabile dell'antisenso. I progetti antisenso erano generalmente visti come progetti suicidi, dice. Potresti impiegare molto tempo a farlo funzionare e non funzionerebbe mai. Rimarresti senza niente da mostrare. La maggiore potenza dell'RNAi, crede Echeverri, dovrebbe produrre terapie migliori. E poiché sarà necessario meno farmaco per silenziare un gene, dovrebbero esserci meno effetti collaterali.

Le persone hanno lottato con l'antisenso, ed ecco che arriva una tecnologia che funziona davvero, concorda Jon Wolff, direttore scientifico di Mirus, un'azienda di terapia dell'RNA a Madison, WI. L'antisenso è difficile da riprodurre, ma l'RNAi è qualcosa che funziona fin da subito.

Ma l'RNAi potrebbe essere solo un'altra tecnologia sopravvalutata? La prova è nel budino, dice Echeverri. Negli ultimi due, tre anni, RNAi ha appena preso il sopravvento. Tutti si stanno rivolgendo ad esso; in ogni organismo lo stanno provando. E non sarebbe così popolare se non avesse successo.

Mettere a tacere i dubbi

Nessuno ha ancora provato l'RNAi negli esseri umani, ma una società è vicina: Ribopharma, una startup biotecnologica a Kulmbach, in Germania. Più di un anno prima che il gruppo di Tuschl stupisse la comunità scientifica con le sue notizie, i fondatori di Ribopharma, gli ex docenti della Bayreuth University Roland Kreutzer e Stefan Limmer, scoprirono che i piccoli RNA funzionavano nelle cellule dei mammiferi. O almeno così affermano Kreutzer e Limmer. Non hanno mai pubblicato i loro dati.

Kreutzer e Limmer pensavano che fosse fisicamente impossibile per gli RNA molto lunghi, come quelli usati da Fire e Mello, legarsi tutti in una volta ai loro RNA bersaglio. Solo brevi segmenti si attaccherebbero. Così hanno provato a silenziare i geni dei mammiferi usando RNA abbastanza corti da eludere la risposta immunitaria fatale. Era gioco d'azzardo, dice Limmer. E si è scoperto che funziona davvero. I ricercatori hanno depositato una domanda di brevetto, hanno lasciato i loro lavori di insegnamento e nel giugno 2000 hanno fondato Ribopharma.

I dirigenti di Ribopharma stanno pianificando di iniziare la sperimentazione umana il prossimo anno, probabilmente iniziando con test di piccoli RNA interferenti nel trattamento del melanoma maligno e del cancro del pancreas. Kreutzer e Limmer affermano che i loro costrutti di RNA sono abbastanza stabili da funzionare senza vettori e possono essere iniettati direttamente nel sito di un tumore o nel flusso sanguigno. La società ha raccolto più di 18 milioni di dollari. Ma poiché Ribopharma deve ancora pubblicare i suoi risultati, è difficile valutare le sue affermazioni, affermano altri ricercatori dell'RNA. Hanno fatto alcune cose, dice Sharp del MIT, abbastanza bene... [Ma] è una lunga strada.

Per quanto? Gli atteggiamenti vanno dalle rassicurazioni ottimistiche di Ribopharma al forte pessimismo. David Beach, presidente della startup RNAi Genetica a Cambridge, MA, indica l'odissea decennale dell'antisenso. Non voglio sedermi e discutere che distribuire RNAi in modalità terapeutica sarebbe più semplice, dice.

Ciò che è molto più chiaro è che l'RNAi sta costringendo i biologi a ripensare il ruolo dell'RNA. Negli ultimi anni, i ricercatori hanno scoperto centinaia di geni che codificano per piccole molecole di RNA, chiamate microRNA, in organismi che vanno dalle piante ai vermi fino all'uomo. Come i loro piccoli cugini con RNA interferente, i microRNA sembrano mettere a tacere i geni, ma il loro ruolo nella biologia è per lo più sconosciuto. Molti di loro sono stati altamente conservati nel corso dell'evoluzione; [quindi] devono fare qualcosa di importante, dice il biologo del MIT David Bartel. Nel frattempo, la consapevolezza che l'RNAi è un processo naturale e probabilmente fondamentale nelle piante e negli animali ha contribuito a renderlo uno dei misteri più emozionanti della biologia odierna.

Piccoli geni di RNA possono essere l'equivalente biologico della materia oscura, tutto intorno a noi, ma quasi sfuggendo al rilevamento, ha scritto Gary Ruvkun, un biologo molecolare della Harvard Medical School, nel 2001 sulla rivista Scienza . Cosa stanno facendo questi geni misteriosi? Sospetto che quello che stiamo guardando sia un metodo molto antico per controllare l'espressione genica, dice Zamore.

Se i microRNA sono interruttori che decidono se le cellule staminali diventano neuroni o muscoli, o se le cellule cancerose crescono o muoiono, allora l'interferenza dell'RNA è molto più importante di quanto chiunque immaginasse solo pochi anni fa. Ci siamo semplicemente imbattuti in un ramo completamente nuovo della biologia molecolare di cui non sapevamo prima, afferma Engelke del Michigan.

Per gli ottimisti, queste scoperte fanno presagire il rapido sviluppo di farmaci efficaci. E anche i ricercatori biomedici resi cinici da affermazioni stravaganti per cure magiche pensano che l'RNAi potrebbe essere la cosa reale. L'anno scorso, quando l'RNAi ha funzionato per la prima volta nelle cellule umane, tutti si sono svegliati e hanno detto, mi chiedo se questo sia il proiettile d'argento?', dice Engelke. E potrebbe essere. Può essere.

Aziende che sviluppano interferenze RNA SOCIETÀ PRINCIPALE RNAi FOCUS Alnylam prodotti farmaceutici
(Cambridge, MA)
Terapeutico Benitec
(Brisbane, Australia)
Proprietà intellettuale per la genomica e le terapie Cenix BioScience
(Dresda, Germania)
Identificazione del bersaglio farmacologico e terapie per il cancro Devgen
(Gand, Belgio) Identificazione di target farmacologici e terapie per diabete, depressione e morbo di Parkinson Genetica
(Cambridge, MA)
Identificazione del bersaglio farmacologico per il cancro Mirus
(Madison, WI)
Terapeutica, utilizzando RNA a doppio filamento lungo ribofarma
(Kulmbach, Germania) Terapie per cancro ed epatite C

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