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DNA a lettura rapida in pollici più vicino
Affinché il sequenziamento del DNA diventi una parte di routine della cura del paziente, deve diventare più economico e veloce. Una società chiamata Oxford Nanopore spera di ridurre sia il costo che il tempo necessari per il sequenziamento utilizzando una tecnica chiamata sequenziamento dei nanopori. L'azienda ha ora fatto un'importante dimostrazione della sua tecnologia: per la prima volta, i ricercatori sono stati in grado di identificare le basi del DNA con una precisione quasi totale. Oltre a identificare le quattro basi del DNA, la tecnica può anche rilevare una versione modificata di una delle basi, che potrebbe essere responsabile di provocare il cancro e altre malattie.
Lettore di velocità : Una base di DNA (rossa) passa attraverso un tunnel proteico rivestito da uno zucchero (bolle blu e verdi). Lo zucchero rallenta il DNA mentre si muove attraverso il poro, consentendo l'identificazione della base.
La nuova tecnica consente l'identificazione diretta delle basi senza le etichette fluorescenti e le apparecchiature di imaging utilizzate per il sequenziamento ad alta velocità convenzionale. La lettura diretta del DNA non dovrebbe solo essere più rapida ed economica, ma dovrebbe anche consentire di eseguire analisi più complesse, afferma Jeffrey Schloss, direttore del programma per lo sviluppo tecnologico negli Stati Uniti. Istituto nazionale di ricerca sul genoma umano . La capacità del sistema Oxford Nanopore di rilevare le modificazioni del DNA catalogate da un campo emergente chiamato epigenetica è particolarmente entusiasmante, afferma Schloss. Ad esempio, è stato dimostrato che l'aggiunta di molecole organiche chiamate gruppi metilici a una delle basi svolge un ruolo nello sviluppo di malattie come il cancro. Ma è arduo rilevare queste modifiche utilizzando metodi di sequenziamento convenzionali, quindi gli effetti completi e il motivo per cui si verificano non sono ancora ben compresi.
I ricercatori di Oxford Nanopore non hanno ancora dimostrato di poter elaborare sequenze complete di DNA utilizzando il loro sistema. Tuttavia, i nuovi risultati, pubblicati questa settimana in Nanotecnologia della natura , sono un'importante prova di concetto per il sequenziamento dei nanopori. Hanno dimostrato la fattibilità di tutti i passaggi, afferma Schloss.
Il sistema utilizzato dall'azienda per identificare le basi del DNA è una proteina simile a un tunnel incorporata in una membrana molto simile a quella che circonda le cellule biologiche. Il flusso di ioni attraverso la membrana e attraverso il poro crea una corrente che può essere misurata usando un elettrodo simile a quelli usati per studiare i neuroni in laboratorio. Applicando un forte potenziale elettrico attraverso la membrana, i ricercatori guidano le basi del DNA attraverso il poro. Al passaggio di ciascuna base, modifica la corrente che scorre attraverso il poro in modo caratteristico.
La chiave per far funzionare il metodo è controllare il flusso delle basi attraverso il poro della proteina. Le basi del DNA sono troppo piccole per essere identificate da sole: potrebbero volerci attraversare, afferma James Clarke, uno scienziato dell'Oxford Nanopore. Quindi una molecola di zucchero che riveste l'apertura la gonfia in modo che il DNA non scorra troppo rapidamente. Nelle versioni precedenti del sistema dei nanopori, questa molecola di zucchero era associata piuttosto vagamente al poro, muovendosi dentro e fuori. Ricercatori dell'azienda guidati dal fondatore Hagan Bayley , che è anche professore di chimica all'Università di Oxford, ha permesso di leggere le basi del DNA una dopo l'altra legando chimicamente lo zucchero all'interno del nanoporo.
Oxford Nanopore può identificare le basi, ma non ancora in sequenza. Il sistema che ha dimostrato prevede il passaggio di DNA sminuzzato, non interi filamenti, attraverso il nanoporo. L'azienda sta ora lavorando a una configurazione per alimentare lunghi filamenti di DNA attraverso i pori una base alla volta. Per fare ciò, i ricercatori devono collegare un enzima chiamato esonucleasi al nanoporo. Sperano che le basi vengano tagliate una alla volta dall'enzima e passino attraverso il poro dall'altra parte.
C'è qualche domanda [su] cosa accadrà quando metti lunghi filamenti di DNA davanti al nanoporo, dice Schloss. Formerà un nodo senza speranza?
Questa è solo una delle numerose incognite che i ricercatori devono affrontare. Per rendere la tecnologia veramente scalabile e commercialmente valida, i pori dovranno essere raggruppati in grandi array e l'azienda dovrà sviluppare un modo meno complicato per leggere i segnali elettrici dai pori. Oxford Nanopore afferma che attualmente sta lavorando su entrambi questi problemi.
Una potenziale trappola dell'approccio nanopore-esonucleasi di Oxford, afferma Schloss, è che il DNA verrà distrutto mentre è stato letto, rendendo impossibile la risequenziazione di un filamento per verificare la presenza di errori.
Tuttavia, esistono altri approcci al sequenziamento dei nanopori che sono meno distruttivi. David Deamer , professore emerito di chimica presso l'Università della California, Santa Cruz, che per primo ha ideato il concetto di sequenziamento dei nanopori negli anni '90 ed è consulente scientifico per Oxford Nanopore, sottolinea che questa non è la prima dimostrazione di un sistema di nanopori che può identificare tutte le basi del DNA. L'anno scorso, i ricercatori guidati da Reza Ghadiri allo Scripps Institute, a La Jolla, in California, ha sequenziato un filamento di DNA lungo 10 basi usando un'altra tecnica a nanopori. Il flusso del DNA attraverso il sistema Scripps, che si basa sul concetto originale di Deamer, è controllato da un enzima che agisce come un cricchetto, spostando la molecola in avanti di una base alla volta. Ma questo sistema è troppo lento, avanza alla velocità di una base ogni 10 minuti e i ricercatori di Scripps stanno lavorando per velocizzarlo.
Oxford Nanopore non ha messo tutte le sue uova nello stesso paniere. Ha concesso in licenza la tecnologia per diversi metodi di sequenziamento dei nanopori, tra cui quello di Deamer e un altro che utilizza un nanoporo artificiale: un wafer di silicio perforato con fori su scala nanometrica e rivestito con nanotubi di carbonio la cui conduttanza cambia al passaggio del DNA.
Uno di questi approcci avrà una svolta e sarà in grado di eseguire la sequenza a un ritmo più rapido ed economico di quello che facciamo ora, prevede Deamer. Né i ricercatori di Oxford Nanopore né quelli dei laboratori concorrenti sono disposti a speculare su quando ciò accadrà o su quanto costerebbe un tale sistema per genoma. Ma Schloss afferma che è possibile che uno dei gruppi raggiunga l'obiettivo del 2014 del National Human Genome Research Institute per il successo del sequenziamento dei nanopori.