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Chirurgia del genoma
Modi precisi e semplici per riscrivere i geni umani potrebbero finalmente fornire gli strumenti di cui i ricercatori hanno bisogno per comprendere e curare alcune delle nostre malattie genetiche più mortali. 11 febbraio 2014
Nell'ultimo decennio, poiché la tecnologia di sequenziamento del DNA è cresciuta sempre più velocemente ed economicamente, la nostra comprensione del genoma umano è aumentata di conseguenza. Eppure, fino a poco tempo fa, gli scienziati sono rimasti in gran parte maldestri quando hanno cercato di modificare direttamente i geni in una cellula vivente. Prendi l'anemia falciforme, per esempio. Una malattia debilitante e spesso mortale, è causata da una mutazione in solo uno dei tre miliardi di paia di basi del DNA di un paziente. Anche se questo errore genetico è semplice e ben studiato, i ricercatori sono impotenti per correggerlo e fermare i suoi effetti devastanti.
Ora c'è speranza sotto forma di nuovi strumenti di ingegneria genomica, in particolare uno chiamato CRISPR. Questa tecnologia potrebbe consentire ai ricercatori di eseguire microchirurgia sui geni, modificando in modo preciso e semplice una sequenza di DNA in posizioni esatte su un cromosoma. Insieme a una tecnica chiamata TALENs, inventata diversi anni fa, e un predecessore leggermente più vecchio basato su molecole chiamate nucleasi a dita di zinco, CRISPR potrebbe rendere le terapie geniche più ampiamente applicabili, fornendo rimedi per semplici malattie genetiche come l'anemia falciforme e alla fine anche portando a cure per malattie più complesse che coinvolgono più geni. La maggior parte delle terapie geniche convenzionali posiziona grossolanamente nuovo materiale genetico in una posizione casuale nella cellula e può solo aggiungere un gene. Al contrario, CRISPR e gli altri nuovi strumenti offrono anche agli scienziati un modo preciso per eliminare e modificare specifici frammenti di DNA, anche cambiando una singola coppia di basi. Ciò significa che possono riscrivere il genoma umano a piacimento.
Questa storia faceva parte del nostro numero di marzo 2014
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È probabile che occorrano almeno diversi anni prima che tali sforzi possano essere sviluppati in terapie umane, ma un numero crescente di ricercatori accademici ha riscontrato alcuni successi preliminari con esperimenti che coinvolgono l'anemia falciforme, l'HIV e la fibrosi cistica (vedi tabella sotto). Uno è Gang Bao, un ricercatore di bioingegneria presso il Georgia Institute of Technology, che ha già utilizzato CRISPR per correggere la mutazione delle cellule falciformi nelle cellule umane coltivate in un piatto. Bao e il suo team hanno iniziato il lavoro nel 2008 utilizzando nucleasi a dita di zinco. Quando è uscito TALENs, il suo gruppo è cambiato rapidamente, dice Bao, e poi ha iniziato a usare CRISPR quando quello strumento è diventato disponibile. Mentre ha l'ambizione di lavorare su una varietà di malattie, Bao dice che ha senso iniziare con l'anemia falciforme. Se scegliamo una malattia da trattare usando l'editing del genoma, dovremmo iniziare con qualcosa di relativamente semplice, dice. Malattia causata da una singola mutazione, in un singolo gene, che coinvolge un solo tipo di cellula.
Bao ha un'idea di come funzionerebbe un simile trattamento. Attualmente, i medici sono in grado di curare una piccola percentuale di pazienti con anemia falciforme trovando un donatore umano il cui midollo osseo è una corrispondenza immunologica; i chirurghi possono quindi sostituire alcune delle cellule staminali del midollo osseo del paziente con quelle donate. Ma tali donatori devono essere abbinati con precisione al paziente e, anche in questo caso, il rigetto immunitario, un problema potenzialmente mortale, rappresenta un serio rischio. La cura di Bao eviterebbe tutto questo. Dopo aver raccolto precursori delle cellule del sangue chiamati cellule staminali ematopoietiche dal midollo osseo di un paziente con anemia falciforme, gli scienziati avrebbero usato CRISPR per correggere il gene difettoso. Quindi le cellule staminali corrette dal gene verrebbero restituite al paziente, producendo globuli rossi sani per sostituire le cellule falciformi. Anche se possiamo sostituire il 50 percento, un paziente si sentirà molto meglio, dice Bao. Se sostituiamo il 70%, il paziente guarirà.
Sebbene l'editing del genoma con CRISPR abbia poco più di un anno, sta già reinventando la ricerca genetica. In particolare, offre agli scienziati la possibilità di apportare rapidamente e simultaneamente più modifiche genetiche a una cellula. Molte malattie umane, tra cui malattie cardiache, diabete e condizioni neurologiche assortite, sono influenzate da numerose varianti sia nei geni della malattia che nei geni normali. Estrarre questa complessità con modelli animali è stato un processo lento e noioso. Per molte domande in biologia, vogliamo sapere come interagiscono i diversi geni, e per questo abbiamo bisogno di introdurre mutazioni in più geni, afferma Rudolf Jaenisch, un biologo del Whitehead Institute di Cambridge, Massachusetts. Ma, afferma Jaenisch, l'utilizzo di strumenti convenzionali per creare un topo con una singola mutazione può richiedere fino a un anno. Se uno scienziato vuole un animale con più mutazioni, i cambiamenti genetici devono essere effettuati in sequenza e la tempistica per un esperimento può estendersi in anni. Al contrario, Jaenisch e i suoi colleghi, incluso il ricercatore del MIT Feng Zhang (un membro del 2013 della nostra lista di 35 innovatori sotto i 35 anni), hanno riferito la scorsa primavera che CRISPR aveva permesso loro di creare un ceppo di topi con più mutazioni in tre settimane.
Poiché un sistema CRISPR può essere facilmente progettato per colpire qualsiasi gene specifico, la tecnologia consente ai ricercatori di eseguire esperimenti che ne sondano un gran numero. A dicembre, i team guidati da Zhang e dal ricercatore del MIT Eric Lander hanno creato librerie di CRISPR, ognuna delle quali prende di mira un diverso gene umano. Queste vaste raccolte, che rappresentano quasi tutti i geni umani, sono state messe a disposizione di altri ricercatori. Le biblioteche promettono di accelerare gli studi sull'intero genoma sulla genetica del cancro e di molte altre malattie umane.
Genoma GPS
L'industria delle biotecnologie è nata nel 1973, quando Herbert Boyer e Stanley Cohen hanno inserito nei batteri DNA estraneo che avevano manipolato in laboratorio. Nel giro di pochi anni, Boyer aveva co-fondato la Genentech e l'azienda aveva iniziato a utilizzare E. coli modificato con un gene umano per produrre insulina per diabetici. Nel 1974, Jaenisch , poi al Salk Institute for Biological Studies di San Diego, ha creato il primo topo transgenico utilizzando virus per correggere il genoma dell'animale con un po' di DNA di un'altra specie. In questi e altri primi esempi di ingegneria genetica, tuttavia, i ricercatori si sono limitati a tecniche che inserivano casualmente il DNA estraneo nella cellula. Tutto quello che potevano fare era sperare per il meglio.
Ci sono voluti più di due decenni prima che i biologi molecolari diventassero esperti nel modificare in modo efficiente geni specifici nei genomi animali. Dana Carroll dell'Università dello Utah ha riconosciuto che le nucleasi a dita di zinco, proteine ingegnerizzate segnalate dai colleghi della Johns Hopkins University nel 1996, potrebbero essere utilizzate come strumento programmabile per il targeting genetico. Un'estremità della proteina può essere progettata per riconoscere una particolare sequenza di DNA; l'altra estremità taglia il DNA. Quando una cellula ripara naturalmente quei tagli, può rattoppare il suo genoma copiando dal DNA estraneo fornito. Sebbene la tecnologia abbia finalmente permesso agli scienziati di apportare con sicurezza i cambiamenti dove vogliono su un cromosoma, è difficile da usare. Ogni modifica richiede al ricercatore di progettare una nuova proteina su misura per la sequenza mirata, un compito difficile e che richiede tempo che, poiché le proteine sono pignoli, non sempre funziona.
Le TALEN, un altro significativo progresso nell'editing genetico, sono arrivate nel 2010. Le TALEN sono anche proteine che trovano e tagliano una sequenza di DNA desiderata, ma adattarle a nuovi target genetici è molto più semplice. Sebbene abbiano rappresentato un grande miglioramento rispetto alle dita di zinco, tuttavia, i TALEN sono grandi proteine con cui è difficile lavorare e consegnare nelle cellule.
CRISPR ha cambiato tutto. Sostituisce le proteine che mirano al DNA con un breve pezzetto di RNA che alloggia sui geni desiderati. A differenza delle proteine complesse, l'RNA, che ha quasi la stessa struttura semplice del DNA, può essere prodotto di routine in laboratorio; un tecnico può sintetizzare rapidamente le sequenze di circa 20 lettere che il metodo richiede. Il sistema consente ai ricercatori medici di modificare facilmente un genoma sostituendo, eliminando o aggiungendo DNA.
In poco più di un anno, CRISPR ha iniziato a reinventare la ricerca genetica.
CRISPR sta per brevi ripetizioni palindromiche raggruppate regolarmente interspaziate, gruppi di brevi sequenze di DNA che si leggono in modo simile in avanti e all'indietro, che si trovano in molti tipi di batteri. Gli scienziati hanno osservato per la prima volta gli sconcertanti segmenti di DNA negli anni '80, ma per quasi due decenni non hanno capito che fanno parte di un sistema di difesa batterica. Quando un virus attacca, i batteri possono incorporare sequenze di DNA virale nel proprio materiale genetico, inserendole tra i segmenti ripetitivi. La prossima volta che i batteri incontrano quel virus, usano il DNA in questi cluster per creare RNA che riconoscono le sequenze virali corrispondenti. Una proteina attaccata a uno di questi RNA quindi taglia il DNA virale.
Nel 2012, Emmanuelle Charpentier, una microbiologa medica che studia i patogeni presso il Centro di ricerca sulle infezioni di Helmholtz, e Jennifer Doudna , un collaboratore dell'Università della California, Berkeley, ha dimostrato di poter utilizzare un singolo RNA in combinazione con la proteina di taglio, un enzima chiamato Cas9, per affettare qualsiasi sequenza desiderata di DNA in provetta. Non era ancora chiaro se il metodo avrebbe funzionato nelle cellule animali, ma nel gennaio 2013 è arrivata una svolta drammatica. Zhang e George Church, un genetista della Harvard Medical School, hanno riferito separatamente che il sistema CRISPR/Cas9 potrebbe essere utilizzato per l'editing genetico nelle cellule degli animali, compreso l'uomo.
Ora un ricercatore che vuole inseguire un nuovo gene deve solo sintetizzare la proteina Cas9 e un po' di RNA che corrisponda alle sequenze della regione mirata. L'RNA quindi guida l'enzima al DNA che il ricercatore vuole tagliare. E poiché la stessa proteina di taglio viene utilizzata indipendentemente dal bersaglio, i ricercatori possono progettare esperimenti in cui cambiano più geni in un organismo contemporaneamente utilizzando Cas9 e più guide RNA. Offre il potenziale per fare esperimenti che in passato erano molto difficili o essenzialmente non possibili, afferma Doudna.
Misteri complessi
Zhang del MIT, membro del Broad Institute e del McGovern Institute for Brain Research, è interessato alla genetica dietro la malattia mentale. Per cercare di comprendere queste condizioni complesse, Zhang ha contribuito a sviluppare molteplici strumenti per la modifica di geni e neuroni, tra cui TALEN e optogenetica, una tecnica che prevede il controllo dell'attività dei neuroni con la luce laser. Quando ha sentito parlare per la prima volta di CRISPR, nel 2011, ha iniziato a ingegnerizzarlo per l'uso nelle cellule umane. Ora sta usando CRISPR per aiutare a rivelare i segreti genetici dietro condizioni così devastanti e poco conosciute come la schizofrenia e l'autismo.
Lo strumento consente a Zhang di iniziare a testare sistematicamente alcune delle varianti del DNA che sono state collegate alle malattie. Sebbene siano stati fatti molti progressi nell'ultimo decennio verso l'identificazione di geni comuni nelle persone con queste condizioni, capire come questi geni si relazionano ai sintomi è una sfida scoraggiante. Quello che impari dal sequenziamento è solo un'osservazione, dice Zhang: per capire se un gene sospetto sta effettivamente causando la condizione, devi introdurre la specifica mutazione in cellule o organismi sani e vedere cosa va storto. Se la cellula o l'organismo mutato ha caratteristiche che imitano la malattia umana, questa è la prova che implica il gene.
Zhang può ricreare, sia nei topi di laboratorio che nelle cellule umane in coltura, le varianti genetiche trovate nelle persone con autismo e schizofrenia. Puoi inserire una mutazione umana nel gene corrispondente in un animale da laboratorio e poi vedere: quell'animale diventa meno socievole o ha un deficit di apprendimento? lui dice. Quindi, aggiunge, è possibile studiare le differenze nel comportamento e nella fisiologia dei neuroni coltivati in laboratorio cresciuti da cellule staminali che sono state modificate con la stessa mutazione. Con le mutazioni di un singolo gene, inizieremo a vedere gli aspetti della funzione biologica che sono coinvolti nell'autismo, dice.
Zhang sta anche usando CRISPR per apportare più cambiamenti genetici contemporaneamente. Ciò diventa particolarmente importante con malattie complesse come l'autismo e la schizofrenia, che per la maggior parte non sono causate dal tipo di singolo cambiamento del DNA dietro l'anemia falciforme. Pazienti diversi sono affetti da raccolte diverse di mutazioni. Risolvere un enigma di tale immensa complessità richiederà studi ampi e sistematici sugli effetti di vari geni e sul modo in cui interagiscono. CRISPR rende possibili tali studi, afferma Zhang, e sarà importante per trovare trattamenti per una varietà di malattie complesse. Capiremo di più sui percorsi e sui meccanismi della malattia, dice. Questa conoscenza informerà tutti i tipi di sviluppo di farmaci.
Bambini firmati
Alla fine dell'anno scorso, Doudna, Zhang, Church e altri due pionieri dell'editing del genoma hanno fondato una startup che svilupperà nuovi trattamenti per le malattie genetiche umane. A novembre l'azienda, Medicinali rilasciati , ha annunciato di aver raccolto 43 milioni di dollari in capitale di rischio e ha affermato che prevede di utilizzare tecnologie di modifica del genoma contro un'ampia gamma di malattie.
Il lancio di Editas dovrebbe beneficiare di una rinascita dell'interesse per la terapia genica grazie ad anni di miglioramenti tecnologici, inclusi meccanismi più sicuri per la somministrazione del trattamento. Il panorama è cambiato per la terapia genica, afferma Church. (Non ci sono ancora terapie geniche approvate negli Stati Uniti, anche se alcune sono in fase di sperimentazione umana.) Ma dice che le terapie che Editas svilupperà saranno fondamentalmente diverse dai vecchi approcci che utilizzano un virus per inserire un gene nelle cellule.
Forse gli scienziati potrebbero riscrivere i geni normali in modo che gli esseri umani possano combattere meglio le infezioni.
Fare una modifica o una cancellazione è fuori portata per la maggior parte di questi semplici metodi virali, afferma Church. E cancellare un po' di DNA, piuttosto che aggiungere un gene, potrebbe davvero essere la chiave per curare molte malattie. Prendi la malattia di Huntington. La condizione cerebrale fatale deriva da un accumulo di una proteina tossica nei neuroni. L'aggiunta di una copia sana del gene alla cellula non influenzerebbe l'attività velenosa di quella proteina: la versione disfunzionale originale deve essere riscritta. Con i nuovi strumenti di modifica del genoma, afferma Church, potrebbe essere possibile riscrivere il DNA difettoso: non sei limitato ad aggiungere qualcosa che manca. E, aggiunge, quando inizi a capire che le versioni più comuni dei geni non sono necessariamente le versioni ideali, allora ti rendi conto che questo è un campo molto più ampio. Forse gli scienziati potrebbero riscrivere i geni normali in modo che gli esseri umani possano combattere meglio le malattie infettive. Potrebbero persino essere in grado di scuotere i percorsi molecolari coinvolti nell'invecchiamento.
Church prevede anche che se l'editing del genoma viene utilizzato per curare le malattie infantili, alcuni scienziati saranno tentati di usarlo per ingegnerizzare gli embrioni durante la fecondazione in vitro. I ricercatori hanno già dimostrato che l'editing del genoma può riscrivere le sequenze del DNA negli embrioni di ratto e topo e, alla fine di gennaio, ricercatori cinesi hanno riferito di aver creato scimmie geneticamente modificate utilizzando CRISPR. Con tali tecniche, il genoma di una persona potrebbe essere modificato prima della nascita o, se sono state apportate modifiche alle uova o alle cellule produttrici di sperma di un potenziale genitore, anche prima del concepimento.
Queste possibilità sollevano questioni etiche. Ma se i ricercatori dimostrano di poter correggere in sicurezza le malattie modificando il genoma, è inevitabile che alcuni genitori vogliano anche alterare i genomi di embrioni sani. Se puoi prevenire il ritardo mentale con la terapia genica, presumendo che sia consentito, allora c'è un intero spettro di sfide intellettuali che saranno discusse, dice Church.
È probabile che tali discussioni si surriscaldino man mano che CRISPR diventa più ampiamente utilizzato. Per ora, però, la tecnologia è ancora in evoluzione: mentre ricercatori come Bao, Church e Zhang sperano di curare alcune delle nostre malattie più intrattabili, gran parte del loro tempo è ancora dedicato alla messa a punto dello strumento e all'esplorazione delle sue possibilità. Ma anche in questi primi giorni, CRISPR ha già trasformato il modo in cui questi ricercatori pensano alla manipolazione del genoma. Non sono più maldestri.